經(jīng)磷酸化提高VEGFR2結(jié)合蛋白的生物活性、理化性質(zhì)和藥代動力學(xué)特性
【引言】
VEGF受體2（VEGFR2）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在實體瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中的重要作用促使人們開發(fā)出具有最小旁觀者效應(yīng)的抑制劑。近年來，Adnectin-C在腫瘤治療中引起了廣泛的關(guān)注。
【成果介紹】
為了克服Adnectin存在的問題，本文設(shè)計了一種新型的Adnectin C，將其融合到含有Pro/Ala/Ser（PAS）重復(fù)殘基的可生物降解多肽中。用標(biāo)準(zhǔn)方法比較大腸桿菌表達(dá)的重組融合蛋白和未融合蛋白的生物活性、理化性質(zhì)和藥代動力學(xué)特性。使用Linseis STA PT1600熱分析儀器進(jìn)行DSC和TG實驗。動態(tài)光散射（DLS）分析表明，磷酸化Adnectin C的粒徑增加了約2倍，凈電荷略有變化。此外，PAS序列的融合提高了其抗熱誘導(dǎo)聚集形式生長的穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和表面等離子體共振實驗分別證實了酶聯(lián)蛋白C的高受體結(jié)合和改進(jìn)的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)。藥代動力學(xué)研究顯示，單次靜脈注射給雌性BALB/C小鼠后，Adnectin C-PAS#1（200）的最終半衰期顯著增加了4.57倍。結(jié)果表明，磷酸化可以作為開發(fā)Adnectin衍生藥物的一種更好的給藥策略，提高患者的依從性。
【圖文導(dǎo)讀】
圖1：純化重組蛋白的蛋白印跡分析和15%SDS-PAGE：純化Adnectin C的電泳遷移率。Lane 1：蛋白質(zhì)標(biāo)記，Lane 2，3：純化蛋白的洗脫1和2（純化蛋白分別為0.2mg/ml）；（a右）純化連接蛋白C-PAS#1（200）的電泳遷移率。一道：蛋白質(zhì)標(biāo)記；第二道至第四道：純化蛋白質(zhì)的洗脫2-4（分別為0.1、0.3和1mg/ml純化蛋白）。Western-blot分析鑒定出：（b 左）Adnectin C；（b右）Adnectin C-PAS 1（200）的特定鍵。箭頭顯示產(chǎn)品預(yù)期尺寸的范圍。完整長度的印跡和凝膠如補(bǔ)充圖S2-S4所示。
圖2：流體動力學(xué)半徑和質(zhì)譜表征。（a）Adnectin C主峰在96.35nm處；（b）Adnectin C-PAS#1（200），主峰在192.3nm。MALDITOF/TOF波譜顯示，Adnectin c的分子量為11374.4160Da；Adnectin c-PAS#1（200）為28076.5703Da。完整的MALDI/TOF質(zhì)譜在補(bǔ)充圖S5中給出。
圖3：（a） 7 cm IPG條帶上磷酸化Adnectin C和天然蛋白的IEF。兩種蛋白質(zhì)在pI=6.5-6.8時具有相似的凈電荷。1道為標(biāo)記，2道為Adnectin C-PAS 1（200），3道為Adnectin C。Zeta電位分布曲線為：（b）Adnectin C；（c）Adnectin C-PAS 1（200）。測量顯示，Adnectin C-PAS#1（200）（-5.28mV）和天然蛋白（?6.15mV）之間的zeta電位差異可以忽略不計。
圖4：不同溫度和凍融條件下蛋白質(zhì)聚集性的熱分析和評價：（a）DSC熱圖；（b）雙態(tài)去折疊酶解結(jié)合蛋白C和天然蛋白的TG曲線。樣品在pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中制備，并以2°C/min的升溫速率在惰性氣氛中進(jìn)行分析。在兩個溫度圖中，觀察到相對于天然蛋白的Pasylized Adnectin C和天然蛋白質(zhì)的可忽略的變化；（c）在規(guī)定的溫度和孵育時間下，PASylated Adnectin C和天然蛋白質(zhì)聚集。加熱后A340nm的大幅度增加表明熱穩(wěn)定性降低。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（三個重復(fù)）。重組蛋白（<0.01）的聚集性（<0.01）和重組蛋白（<0.01）。觀察到：（d）天然蛋白（96.35nm-733.7nm）和（e）磷酸化蛋白（192.3-266.6nm）的峰位移。觀察到低聚集形式的磷酸化。
圖5：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）與rhVEGFR2的結(jié)合。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（三個重復(fù)）。PASylated Adnectin在低于天然蛋白的濃度下達(dá)到飽和。
圖6：.Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）對培養(yǎng)的HUVECs的毒性評估（a），重組蛋白對VEGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖的抑制作用（b），以及Adnectin C-PAS 1（200）（C）作用機(jī)制的示意圖。Te數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（三個重復(fù)）。星號顯示樣本的存活率與VEGF組相比有顯著性差異（****p<0.0001）。
圖7：Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs遷移：（a）重組蛋白抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs通過跨孔膜的遷移。Te數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（三個重復(fù)）；#表示與VEGF組（陽性對照）有顯著差異（p<0.0001）。星號表示與未處理（陰性）對照組的顯著差異（**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）；（b）染色膜的代表性照片表明，與對照組相比，這兩種蛋白質(zhì)顯著抑制了HUVEC的遷移（見補(bǔ)充圖S6中的原始照片）。
圖8：BALB/C小鼠5mg/kg給藥后Adnectin C和Adnectin C-PAS#1（200）的藥代動力學(xué)研究。Te圖顯示，磷酸化蛋白在循環(huán)中的停留時間比天然蛋白長。
【結(jié)論】
工程化的Adnectin C除了在體外維持其藥理作用外，在穩(wěn)定性、藥代動力學(xué)參數(shù)和生物活性方面具有促進(jìn)磷酸化的作用。然而，需要臨床前的數(shù)據(jù)來證實磷酸化Adnectin-C優(yōu)于Adnectin-C。磷酸化可能是延長Adnectin半衰期的一種合適的方法，其特征可與peg酸化相媲美?；谶@些結(jié)果，磷酸化Adnectin C可能是一種很有前途的臨床治療藥物